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CFDA最新发布:《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》

国家食药总局官网 2017-6-21  

植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定 BJS201707

1 范围

本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。

本方法适用于核桃露(乳)、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。

2 原理

提取试样中基因组DNA,以DNA为模板,利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测,同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值,判定试样中是否含有该源性成分。

3 试剂和材料

除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

3.1 核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为:

核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’

核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’

核桃探针:5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’

3.2 花生源性成分Ara b2基因检测用引物(对)序列为:

花生5’端引物:5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’

花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’

花生探针:5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’

3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物(对)序列为:

杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’

杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’

杏仁探针:5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’

3.4 芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物(对)序列为:

芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’

芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’

芝麻探针:5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’

3.5 榛子源性成分oleosin基因检测用引物(对)序列为:

榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’

榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’

榛子探针:5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’

3.6 大豆源性成分Lectin基因检测用引物(对)序列为:

大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

大豆探针:5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’

3.7 真核生物18SrRNA内参照检测用引物(对)序列为:

内参照5’端引物:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’

内参照3’端引物:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’

内参照探针:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’

3.8 CTAB缓冲液:55mmol/L CTAB,1400mmol/L NaCl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris,用10%盐酸调节pH至8.0,121℃高压灭菌20min,备用。

3.9 蛋白酶K:20mg/mL。

3.10 苯酚:氯仿:异戊醇(体积比:25:24:1)。

3.11 异丙醇。

3.12 70%乙醇。

3.13 Taq DNA聚合酶。

3.14 dNTP混合液。

3.15 TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。

3.16 10×PCR缓冲液:200mmol/L KCl,15mmol/L MgCl2,200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)。

4 仪器和设备

4.1 组织研磨器。

4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

4.3 恒温水浴锅。

4.4 离心机:离心力12,000g。

4.5 微量移液器(0.5μL~10μL,10μL~100μL,10μL~200μL,100μL~1000μL)。

4.6 实时荧光PCR仪。

4.7 涡旋振荡器。

4.8 天平:感量0.01g。

5 分析步骤

5.1 试样总DNA的提取

固体样品:将样品粉碎后称取0.3~0.6g,按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

液体样品:取1mL样品于Eppordorf管中,加入1倍体积的异丙醇,混合均匀,室温下沉淀5min,室温下以12,500rpm 离心5min,弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA,也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

(1)将处理后的样品加入2mL离心管中,加入600μL CTAB缓冲液和40μL蛋白酶K溶液,振荡混匀,65℃孵育1h(过夜孵育更好), 期间每隔10min振荡混匀;

(2)加入500μL的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),振荡抽提10min,室温下以12,500rpm 离心10 min;

(3)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500rpm 离心10min;

(4)弃去上清液,用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA;

(5)小心吸取上清,加入200μL氯仿:异戊醇(24:1),振荡抽提,室温下以12500rpm离心15min;

(6)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500rpm 离心10 min;

(7)弃去上清液,沉淀用70%乙醇洗涤,离心1min,晾干,溶于50μLTE 缓冲液中。

5.2 DNA浓度和纯度的测定


取1μL DNA溶液,使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量,OD260/280值应在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。


5.3 实时荧光PCR扩增

反应体系总体积为25μL,其中10×PCR缓冲液5μL,正反向引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)1μL,dNTPs(10μmol/L)2μL,Taq DNA聚合酶(2.5U)0.2 μL,DNA模板(10-100ng/μL)2μL,用灭菌去离子水补足至总体积25μL。真核生物内参照的反应体系同上,仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。

反应参数:50℃ 2min;95℃ 15min;95℃ 15s,60℃ 1min,40个循环。

5.4 实验对照

检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照,以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照,以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。

6 结果判断与表述

6.1 质量控制

以下条件有一条不满足时,结果视为无效:

(a)空白对照:无FAM荧光信号检出;

(b)阴性对照:无FAM荧光信号检出;

(c)阳性对照:有FAM荧光信号检出,且FAM通道出现典型的扩增曲线,Ct值≤35.0;

(d)内参对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0。

6.2 结果判定

(a)如Ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性;

(b)如Ct值≥40.0,则判定为被检样品阴性;

(c)如35.0<Ct值<40.0,则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0<Ct值<40.0,则判定被检样品可疑。

6.3 结果表述

结果为阳性者,结合产品标识,表述为“检出XX源性成分”。

结果为阴性者,结合产品标识,表述为“未检出XX源性成分”。

结果为可疑者,结合产品标识,表述为“XX源性成分可疑”。

7 防污染措施

检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。

本方法负责起草单位:河北省食品检验研究院。

验证单位:中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。

主要起草人:周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。

国家食药总局官网(2017.06.21)



原文链接:http://www.sfda.gov.cn/WS01/CL0087/174048.html
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